В наши дни, в эпоху персонализированной медицины, всякий раз, когда исследователи обнаруживают новое лекарство от рака, они должны точно показать, как оно работает, и доказать, что оно оказывает свое терапевтическое действие, поражая определенную молекулярную мишень.
Это детальное научное понимание молекулярного механизма действия лекарственного средства абсолютно необходимо для его безопасного и эффективного использования , включая отбор пациентов для лечения с использованием биомаркеров или его комбинации с другими видами лечения.
Ключевые шаги, которые исследователи должны предпринять при применении биомаркеров, изложены в «Фармакологическом контрольном журнале», золотом стандарте, который направляет создание новых методов лечения, который был разработан здесь, в Институте исследований рака, Лондон.
Но хотя у нас обычно есть хорошее понимание того, как современные методы лечения оказывают свои первичные эффекты, это не означает, что более детальное изучение молекулярной фармакологии лекарственного средства не может преподнести несколько сюрпризов.
Хорошим тому примером является исследование, только что опубликованное в « Научных отчетах» под руководством доктора Альберта Антолина, профессора Биссана Аль-Лазикани и меня в соавторстве в ICR.
Наше исследование было посвящено четырем лекарственным препаратам, относящимся к важной группе препаратов, называемых ингибиторами PARP. Это препараты, которые блокируют функцию белков, известных как PARPs (полное название поли-АДФ рибозных полимераз), которые выполняют ключевой процесс, связанный с репарацией ДНК, и, таким образом, используют дефицит BRCA и других белков ответа на повреждение ДНК в раковых клетках – эффект известный как синтетическая летальность .
Ингибиторы PARP являются одними из самых инновационных и захватывающих лекарств в лечении рака сегодня. Благодаря большому вкладу исследований, проведенных здесь, в ICR, они стали первыми противораковыми препаратами, нацеленными против наследственных генетических нарушений, когда они были одобрены для женщин с раком яичников, у которых есть мутации BRCA зародышевой линии. С тех пор ингибиторы PARP также были лицензированы для женщин с раком молочной железы, которые унаследовали мутации BRCA, а также демонстрируют преимущества для некоторых мужчин с раком простаты, у которых при раке обнаруживаются мутации в BRCA и других генах репарации ДНК.
Мы знаем, что все четыре одобренных препарата-ингибитора PARP хорошо работают для пациентов, поэтому было немного удивительно обнаружить, что четыре лицензированных ингибитора демонстрируют очень разные уровни молекулярной селективности в некоторых их взаимодействиях с белками.
Уже было известно, что, хотя все четыре одобренных препарата обладают способностью ингибировать ключевые белки PARP (наиболее эффективно действующие на PARP1 и PARP2), они, тем не менее , демонстрируют некоторые явные различия в их активности в отношении 17 различных членов семейства PARP. Также следует отметить, что лицензированные препараты PARP по-разному влияют на так называемое «улавливание PARP».
В нашем новом исследовании с использованием объективного, масштабного вычислительного и экспериментального анализа показано, в какой степени четыре одобренных препарата обладают дополнительной и удивительно различной активностью в отношении другой группы белков, для которых они не предназначены, – протеинкиназ , которые сами по себе являются основными целями многих других лекарств от рака.
Понимание разнообразия нецелевых эффектов лечения на молекулярном уровне может помочь обнаружить вклад как в полезное действие лекарств, так и в нежелательные побочные эффекты – и в будущем может точно определить, как они используются в клинику, и как они могут лучше всего сочетаться с другими методами лечения.
Эффекты вне цели
Уже была доступная информация о том, что ингибиторы PARP могут связываться с определенными протеинкиназами. Наше новое исследование предоставило наиболее полную оценку степени взаимодействия ингибиторов PARP на молекулярном уровне с семейством протеинкиназ.
Масштабный характер нашего исследования определяет общую картину влияния нецелевых киназ одобренных PARP-целевых препаратов.
Также впервые было показано, что ингибиторы PARP обладают такими мощными эффектами, не связанными с мишенью, при действительно низких концентрациях лекарственного средства – ниже часто критической пороговой концентрации в один микромолярный слой, которая может быть легко достигнута у пациентов.
Наше исследование поднимает ряд вопросов. Могут ли, например, эффекты на киназы иметь клиническое значение или они могут быть использованы терапевтически в будущем?
Более конкретно, могут ли эффекты, не связанные с мишенью киназы, помочь объяснить и потенциально избежать определенных токсических побочных эффектов или быть использованы для лечения дополнительных типов рака или направлять использование ингибиторов PARP в комбинациях лекарственных препаратов, таких как применение наряду с иммунотерапией?
Кроме того, наше исследование повышает вероятность того, что мы могли бы потенциально использовать двойную активность лекарств против как PARP, так и киназных мишеней в будущем дизайне лекарств – тип «полифармакологии», определяемый как разработка или использование фармацевтических агентов, которые действуют на множественные цели или пути заболевания.
Крупномасштабный вычислительный прогноз и экспериментальный скрининг
Сначала мы применили метод компьютерного скрининга для выявления протеинкиназ, которые могли бы взаимодействовать с четырьмя утвержденными ингибиторами PARP – в отношениях типа «замок и ключ».
Использование нескольких различных вычислительных методов позволило нам предсказать, что клинические ингибиторы PARP действительно могут потенциально связываться со многими протеинкиназами – в разной степени, в зависимости от рассматриваемого препарата PARP.
Кроме того, мы использовали крупномасштабную, несмещенную технологическую платформу связывания белка, чтобы экспериментально проверить фактическую способность ингибиторов PARP связываться с членами семейства протеинкиназ («кином») – и выявить любые различия между препаратами PARP.
Взяв эти два подхода параллельно, мы обнаружили, что, хотя вычислительный подход был полезен для указания на потенциал препаратов PARP для взаимодействия со многими различными протеинкиназами, точная предсказательная сила была ограничена, что указывает на необходимость дальнейшего совершенствования методологии для будущего Приложения.
Используя платформу технологии связывания белка для скрининга взаимодействия с сотнями киназ, мы обнаружили, что два из четырех одобренных препаратов-ингибиторов PARP способны напрямую взаимодействовать со многими протеинкиназами – связывание рукапариба с 37 и нирапариб, взаимодействующий с 23 протеинкиназами, из которых только 15 были общими. Напротив, талазопариб показал только слабое связывание с двумя киназами, а олапариб не связывался в значительной степени ни с одной из 392 протестированных киназ, что составляет 76 процентов от всего человеческого кинома.
Затем мы провели дополнительные последующие исследования с использованием высокопроизводительного анализа, чтобы измерить способность лекарств-ингибиторов PARP не только связываться с протеинкиназами, но и блокировать функциональную каталитическую активность выбранных киназ в бесклеточных биохимических анализах с очищенные белки. Особый интерес показал, что рукапариб эффективно ингибирует три киназы – CDK16, PIM3 и DYRK1B – в то время как показано, что нирапариб сильно ингибирует две киназы, DRK1B снова, а также DIRK1A.
Как подчеркивалось выше, впервые сообщается, что ингибиторы PARP обладают такими мощными побочными эффектами – ингибированием киназ при воздействии лекарств ниже одного микромолярного уровня. Такие концентрации обычно наблюдаются у пациентов, подчеркивая потенциальную клиническую значимость.
Затем мы проверили, могут ли рукапариб и нирапариб поддерживать свою мощную киназную связь в живых клетках с помощью так называемой аналитической платформы NanoBRET. Важно отметить, что мы продемонстрировали связывание CDK16 как рукапарибом, так и DYRK1A нирапарибом в живых клетках с 50% ингибированием в диапазоне 200-230 нМ. Как и ожидалось из предыдущего профилирования, олапариб был неактивен в анализе живых клеток.
Потенциальное влияние нецелевого ингибирования киназы на клинические профили побочных эффектов
Наши исследования показывают, что четыре одобренных препарата-ингибитора PARP, хотя и одинаково эффективны в клинике, на самом деле проявляют различные молекулярные эффекты, помимо их предполагаемых целей.
Важно отметить, что связывание рукапариба и нирапариба с киназами менее эффективно, чем их связывание с PARP1 и PARP2. Тем не менее, он достаточно силен, чтобы рассмотреть возможные последствия, в том числе потенциальный вклад в неблагоприятные последствия.
В качестве первого шага и для стимулирования дальнейшего интереса мы составили обзор побочных эффектов на основе данных клинических испытаний четырех препаратов ингибитора PARP. Это показало, что, хотя есть общие побочные эффекты, каждый из препаратов имеет свой профиль побочных эффектов.
Мы предполагаем, что необходимы дальнейшие исследования, чтобы решить, могут ли эти различные профили потенциально быть связаны с дифференциальным ингибированием киназы вне цели.
Будущие приложения
Мы считаем, что наши выводы важны, потому что они должны информировать будущие исследования с ингибиторами PARP по ряду возможных направлений, в том числе, потенциально помогая определить, как они применяются в клинике – например, при рассмотрении комбинаций препаратов, таких как иммунотерапия.
Мы также считаем, что подход, который мы здесь использовали для изучения «молекулярной разнородности», можно применять к другим лекарствам, чтобы лучше понять их молекулярные и клинические эффекты и, возможно, максимизировать пользу, которую они приносят пациентам через полифармакологию.
Может быть целесообразно оптимизировать любую желаемую двойную активность по отношению к мишеням семейства PARP и киназы в подходе «дизайнерской полифармакологии».
Одна идея, которую мы предлагаем в публикации, заключается в том, чтобы опираться на мощную активность нирапариба против киназы DIRK1A, которая связана с острым лимфобластным лейкозом у детей с синдромом Дауна .
Разработчики лекарств также могут использовать активность ингибиторов PARP в отношении киназ для производства новых лекарств, которые действуют на « темный кином » – то есть очень большое количество киназ, которые в настоящее время не имеют доступных ингибиторов.
Часто тот факт, что лекарство оказывает нецелевое воздействие, может восприниматься как отрицательный, и это может быть правдой. Но на самом деле для лекарств характерно наличие множества молекулярных взаимодействий, подобных тем, которые мы видели здесь, которые могут способствовать терапевтическому эффекту. Например, ряд противораковых агентов поражает несколько киназ, которые способствуют развитию рака как часть их механизма действия.
Два недавних исследования других исследователей пролили свет на то, как лекарственные средства могут вызывать молекулярные взаимодействия, которые обнаруживаются только после того, как они одобрены для широкого использования.
В одном из них, опубликованном в Science Translational Medicine , использование технологии нокаута гена CRISPR показало, что для нескольких лекарств, проходящих клинические испытания, предлагаемая первичная цель на самом деле не является существенной для выживания раковых клеток. Кроме того, исследователи показали, что лекарства сохраняли свою активность в раковых клетках, в которых предлагаемая молекулярная мишень была выбита CRISPR. Результаты показали, что эти новые развивающие агенты должны оказывать терапевтическое воздействие, воздействуя на разные, до сих пор не ожидаемые молекулярные мишени.
Эффект выбивания мишени на реакцию раковых клеток, которые, как считается, действуют главным образом через эту мишень, теперь может быть добавлен к набору инструментов для проверки правильности цели, причем дополнительный подход заключается в демонстрации устойчивости в раковых клетках, содержащих мутантную форму мишени, которая не дольше связывает препарат.
Во втором исследовании, опубликованном на сервере препринтов bioRxiv , исследователи сравнили действие, с одной стороны, большой коллекции из 397 реальных препаратов или прототипов препаратов, с другой стороны, с последствиями нокаута CRISPR по всему геному специфических генов в группе из 484 линий рака человека, для которых была проведена обширная и систематическая характеристика их генетических особенностей. Результаты являются захватывающими и информативными.
Рассматривая препараты, для которых имеется информация о предлагаемой цели, и данные о которых доступны для нокаута CRISPR этой цели, исследователи обнаружили значительную корреляцию между чувствительностью к лекарственным средствам и номинальной целью только для четверти протестированных агентов. Это увеличилось примерно до половины, если учитывать связь либо с номинальной мишенью, либо с функционально связанным белком. Это оставляет 50% лекарств, в которых нет никакой связи между предполагаемой мишенью и чувствительностью раковых клеток.
Даже учитывая тот факт, что зависимое от концентрации, потенциально неполное фармакологическое ингибирование механически отличается от общего нокаута гена CRISPR, это оставляет очень высокую долю лекарств, для которых чувствительность раковых клеток не может быть объяснена действием на одну молекулярную мишень.
Представляется весьма вероятным, что одним из основных факторов является воздействие на две или более мишени для лекарств – полифармакологию.
Воздействие на химические зонды и лекарства
Возникновение нецелевых эффектов важно не только для применения лекарств у пациентов, но и для применения лекарств и других низкомолекулярных агентов в качестве химических зондов в лабораторных исследованиях, направленных на выявление роли отдельных белков в биологических и болезненных механизмах. , Чтобы использовать химические зонды с уверенностью и избежать вводящих в заблуждение результатов, важно, чтобы химическое инструментальное соединение было как можно более селективным по отношению к намеченной цели и чтобы любые нецелевые эффекты были задокументированы и смягчены.
Наличие крупномасштабных платформ для скрининга и онлайн-ресурсов делает возможность оценки лекарств и зондов для целевых и нецелевых эффектов гораздо более доступной. Использование их настоятельно рекомендуется.
В случае нашего исследования ингибиторов PARP, олапариб будет предпочтительнее, чем три других препарата, которые оцениваются как химический зонд для PARP1 и 2, если считается важным избежать воздействия не по назначению на киназы.
Поэтому, независимо от того, рассматриваете ли вы разработку лекарств для пациентов или зондов для биомедицинских исследований, важно знать как ваши целевые, так и нецелевые эффекты.
Проблема не в целевых эффектах, о которых вы думаете, что вы знаете, а в нецелевых эффектах, о которых вы ничего не знаете.